В 1-й половине XV века при Борисе Александровиче Тверь пережила последний взлет своего могущества как центр самостоятельного княжества. Развернулось обширное строительство. В кремле сооружены каменный княжеский дворец, второй по времени после Боголюбского в Северо-Восточной Руси, каменная соборная колокольня (1407 г.), каменные церкви Ивана Милостивого (1420 г.), Бориса и Глеба (1438 г.), Михаила-Архангела (1455 г.); каменные храмы в Федоровском и Желтиковом монастырях.Экономический подъем города сопровождался обширными экономическими связями и дипломатической активностью (путешествие А. Никитина, участие тверского посла Фомы во Флорентийском соборе).
В 1485 году московские войска заняли Тверь, князь Михаил Борисович бежал в Литву. Тверское княжество прекратило самостоятельное политическое существование и вошло в состав складывавшегося Русского централизованного государства. В 1485-90 гг., Тверь была уделом сына Ивана III Ивана Ивановича, затем городом стали управлять великокняжеские наместники.
В конце XV-XVI веков Тверь осталась крупным торгово-ремесленным центром, в городе велось значительное каменное строительсьво (сохранилась церковь Троицкая, что за Тьмакой рекой, т. н. "Белая Троица"). В декабре 1569 года Тверь была разграблена опричным войском Ивана IV Грозного, шедшим походом на Новгород.
В начале XVII века в период социально-экономического и политического кризиса, переживаемого Российским государством, Тверь подвергалась нападениям отрядов польско-литовских интервентов. В 1606 году жители Твери отразили нападение, однако в 1609 году интервентам удалось захватить Тверь. В том же году князь М. В. Скопин-Шуйский, идя с войском из Новгорода в Москву, выбил захватчиков из Твери. В результате польско - литовского "разорения" Тверь запустела. Учитывая важность стратегического положения города на пути из Москвы в Новгород правительство царя Михаила Федоровича назначило воеводой в Твери Д.П. Пожарского-Лопату, который в короткий срок сумел восстановить разрушенные во время "смуты" укрепления.
В середине XVII века Тверь в основном оправилась от последствий польско-литовской интервенции. В кремле был сооружен комплекс архирейского двора, воздвигнута каменная Владимирская башня (1674 г., находилась напротив современного Дома офицеров), на площади перед ней - Гостиный двор с торговыми рядами, в 1696 г. перестроен городской собор. Дальнейшее развитие в Твери получило кузнечное ремесло. На территории Загородского посада разместились Стрелецкая и Ямская слободы.